KIT ELISA ARN dublu catenar (ARNds).

Acest kit este un test ELISA (Enzyme-Linked Imunosorbent Assay) cu un sistem biotină-Streptavidină, pentru măsurarea cantitativă a ARNds cu lungimea peste 60 de perechi de baze (bp), indiferent de secvență.Placa a fost pre-acoperită cu anticorp anti-dsARN.Se adaugă dsARN prezent în probă și se leagă de anticorpii acoperiți pe godeuri.Și apoi se adaugă anticorpi anti-dsARN biotinilat și se leagă de dsARN din probă.După spălare, se adaugă HRP-Streptavidin și se leagă de anticorpul anti-dsARN biotinilat.După incubare, HRP-streptavidina nelegată este spălată.Apoi, soluția de substrat TMB este adăugată și catalizată de HRP pentru a produce un produs de culoare albastră care s-a schimbat în galben după adăugarea soluției de stopare acidă.Densitatea galbenului este proporțională cu cantitatea țintă de dsARN capturată în placă.Absorbanța este măsurată la 450 nm.

Aplicație

Acest kit este pentru măsurarea cantitativă a ARNds rezidual.

Componentele trusei

Depozitare și stabilitate

1. Pentru trusa nefolosită: Întregul kit poate fi depozitat la 2~8℃ în termen de valabilitate.Pentru stabilitatea depozitării, trebuie evitată lumina puternică.

2. Pentru trusa folosită: Odată ce microplaca este deschisă, acoperiți godeurile neutilizate cu sigilant pentru plăci și întoarceți-vă în punga de folie care conține pachetul de desicant, sigilați cu fermoar punga din folie și reveniți la 2~8℃ cât mai curând posibil după utilizare.Alți reactivi trebuie returnați la 2~8℃ cât mai curând posibil după utilizare.

Materiale necesare, dar nefurnizate

1. Cititor de microplăci cu filtru de 450±10nm (mai bine dacă poate detecta la 450 și 650 nm lungime de undă).

2. Agitator pentru microplaci.

3. Vârfuri și tuburi de centrifugă fără RNază.

Diagramă de operare

Înainte de a începe

1. Aduceți toate componentele kit-ului și mostrele la temperatura camerei (18-25℃) înainte de utilizare.Dacă kitul nu va fi epuizat într-o singură dată, vă rugăm să scoateți doar benzi și reactivi pentru experimentul prezent și lăsați benzile și reactivii rămași în starea necesară.

2. Tampon de spălare: se diluează 40mL de tampon de spălare concentrat 20x cu 760mL de apă deionizată sau distilată pentru a prepara 800mL de tampon de spălare 1x.

3. Standard: centrifugați scurt sau centrifugați soluția stoc înainte de utilizare.Concentrația celor patru standarde furnizate este de 5ng/μL.Pentru standardele UTP și pUTP dsRNA, vă rugăm să diluați soluția stoc la 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL cu tampon STE pentru a desena curba standard.Pentru standardele N1-Me-pUTP dsRNA, vă rugăm să diluați soluția stoc la 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL cu tampon STE pentru a desena curba standard.Pentru standardul 5-OMe-UTP dsRNA, vă rugăm să diluați soluția stoc la 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL cu tampon STE pentru a desena curba standard.Recomandăm că standardele pot fi diluate după următoarele diagrame:

4. Anticorp de detectare biotinilat și soluție de lucru HRP-streptavidină: rotește scurt sau centrifugă soluția stoc înainte de utilizare.Se diluează la concentrația de lucru cu tampon de diluție.

5. Substarea TMB: aspirați doza necesară de soluție cu vârfuri sterilizate și nu aruncați din nou soluția reziduală în flacon.Substatul TMB este sensibil la lumină, nu expuneți substratul TMB la lumină pentru o perioadă lungă de timp.

Folosind protocolul

1. Determinați numărul de benzi necesare pentru test.Introduceți benzile în rame pentru utilizare.Fâșiile de plăci rămase care nu sunt utilizate în acest test trebuie reambalate în punga cu desicant.Închideți ermetic punga pentru depozitare la frigider.

2. Adăugați 100 μL fiecare dintre diluțiile standard, martor și probe în godeurile corespunzătoare.Acoperiți cu placa de etanșare.Se incubează timp de 1 oră la temperatura camerei cu agitare la 500 rpm.Probele trebuie diluate cu tampon STE la concentrația adecvată pentru o analiză precisă.

3. Etapa de spălare: Aspirați soluția și spălați cu 250μL tampon de spălare în fiecare godeu și lăsați-o să stea timp de 30 de secunde.Aruncați tamponul de spălare complet prin fixarea farfuriei pe hârtie absorbantă.Se spală complet de 4 ori.

4. Adăugați 100μL de soluție de lucru de anticorpi de detectare biotinilat în fiecare godeu.Acoperiți cu placa de etanșare.Se incubează timp de 1 oră la temperatura camerei cu agitare la 500 rpm.

5. Repetați etapa de spălare.

6. Adăugați 100μL de soluție de lucru HRP-streptavidină în fiecare godeu.Acoperiți cu placa de etanșare.Se incubează timp de 30 de minute la temperatura camerei cu agitare la 500 rpm.

7. Repetați etapa de spălare din nou.

8. Adăugați 100μL de soluție de substrat TMB în fiecare godeu.Acoperiți cu placa de etanșare.Se incubează timp de 30 min la RT A se proteja de lumină.Lichidul va deveni albastru prin adăugarea de soluție de substrat.

9. Adăugați 50μL de soluție stop în fiecare godeu.Lichidul va deveni galben prin adăugarea de soluție stop.Apoi rulați cititorul de microplăci și efectuați imediat măsurarea la 450 nm.

Calculul rezultatelor

1. Faceți o medie a citirilor duplicate pentru fiecare standard, control și probă și scădeți densitatea optică standard zero medie.Construiți o curbă standard cu absorbanța pe axa verticală (Y) și concentrația dsARN pe axa orizontală (X).

2. Se recomandă efectuarea calculului cu un software de ajustare a curbei bazat pe computer, cum ar fi curve expert 1.3 sau ELISA Calc într-un model de potrivire neliniară cu 5 sau 4 parametri.

Performanţă

1. Sensibilitate:

limita inferioară de detecție: ≤ 0,001 pg/μL (pentru UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (pentru 5-OMe-UTP-dsRNA).

limita inferioară de cuantificare: 0,0156 pg/μL (pentru UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (pentru N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (pentru 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precizie: CV-ul intra-testare ≤10%, CV-ul inter-testare ≤10%

3. Recuperare: 80% ~ 120%

4.Liniaritate: 0,0156-0,5 pg/μL (pentru ARNds PUTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (ARN dsRNA pentru N1-Me-pUTP), 0,0625-1 pg/μL (pentru 5-OMe-UTP-ARNds).

Considerații

1. Temperatura și timpul de reacție TMB sunt critice, vă rugăm să le controlați strict conform instrucțiunilor.

2. Pentru a obține o reproductibilitate și o sensibilitate bune a testului, spălarea adecvată a plăcilor pentru a elimina excesul de reactivi nereacționați este esențială.

3. Toți reactivii trebuie amestecați bine înainte de utilizare și evitați bubuiturile în timpul adăugării probei sau a reactivilor.

4. Dacă s-au format cristale în tamponul de spălare concentrat (20x), încălziți la 37 ℃ și amestecați ușor până când cristalele sunt complet dizolvate.

5. Evitați testarea probelor care conțin azidă de sodiu (NaN3), deoarece ar putea distruge activitatea HRP, ceea ce duce la subestimarea cantității de dsARN.

6. Evitați contaminarea cu RNază în timpul testului.

7. Standardul/probă, anticorpul de detectare și SA-HRP pot fi, de asemenea, conduse la RT fără agitare, dar acest lucru poate determina scăderea sensibilității de detectare de o ori.În acest caz, vă recomandăm ca standardele UTP și pUTP dsRNA să fie diluate de la 2pg/μL, standardele N1-Me-pUTP dsARN să fie diluate de la 4pg/μL și standardul 5-OMe-UTP dsRNA să fie diluat de la 8pg/μL.În plus, se incubează soluția de lucru HRP-streptavidină timp de 60 de minute la temperatura camerei.Nu utilizați agitatorul de balon, deoarece agitatorul de balon poate duce la un rezultat inexact.

Rezultat tipic

1. Date curbe standard

2. Calculul curbei standard

3. Interval de detectare a căptușelii: 0,0312- 1pg/μL