M-MLV Reverse Transcriptaza
RevScript Reverse transcriptaza este obținută prin tehnologie de inginerie genetică.Are o capacitate mai mare de sinteză a ADNc, stabilitate termică și limită de temperatură de reacție (până la 60°C).Produsul ADNc sintetizat este de până la 10 kb.Îmbunătățește afinitatea șabloanelor și este potrivit pentru transcrierea inversă a șabloanelor de ARN cu structură secundară complexă sau gene cu copie redusă.
Componente
| Componentă | HC2003B (10.000 U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000 U) |
| Transcriptază inversă RevScript (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Starea de depozitare
Acest produs trebuie păstrat la -25°C~-15°C timp de 2 ani.
Definiția unității
O unitate încorporează 1 nmol de dTTP în material insolubil în acid în 10 minute la 37°C folosind ca primeri Oligo(dT).
Configurarea reacției
1.Denaturarea șablonului de ARN (Acest pas este opțional, denaturarea șablonului de ARN ajută la deschiderea structurilor secundare, ceea ce va îmbunătăți randamentul primei catene de ADNc.)
| Componente | Volumul (μL) |
| ddH fără RNază2O | Până la 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) sau Primer aleatoriu (50 μmol/L) Sau primeri specifici genei (2 μmol/L) | 1 |
| sau 1 | |
| sau 1 | |
| șablon ARN | X a |
Note:
1) a: ARN total: 1-5 ug sau ARNm: 1-500 ng
2) Se incubează la 65°C timp de 5 minute, apoi se transferă pe gheață imediat pentru a se răci timp de 2 minute.Scurtă centrifugare pentru a colecta lichidul de reacție, adăugați soluția de reacție de transcripție inversă, așa cum se arată în tabelul următor.Pipetați ușor pentru a amesteca.
1.Prepararea amestecului de reacție (volum de 20 μL)
| Componente | Volumul (μL) |
| Amestecul pasului precedent | 13 |
| 5 × tampon | 4 |
| Mix dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Reverse transcriptază (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor de RNază (40 U/μL) | 1 |
1.Efectuați reacția în următoarele condiții:
| Temperatura (°C) | Timp |
| 25 °Ca | 5 minute |
| 42 °Cb | 15-30 minute |
| 85 °Cc | 5 minute |
Note:
1) a.Incubarea la 25°C timp de 5 minute este necesară numai pentru utilizarea hexamerilor aleatori.Vă rugăm să omiteți acest pas când utilizați Oligo (dT)18sau Gene Specific Primer.
2) b.Temperatura recomandată de transcripție inversă este de 42°C. Pentru șabloanele cu structuri secundare complicate sau conținut ridicat de GC, se recomandă creșterea temperaturii de reacție la 50-55°C.
3) c.Se încălzește la 85°C timp de 5 minute pentru a inactiva reversul transcriptaza.
4) Produsul poate fi utilizat direct în reacții PCR sau qPCR sau depozitat la -20°C pentru depozitare pe termen scurt.Se recomanda alinierea produselor si depozitarea la -80°C pentru depozitare pe termen lung.Evitați înghețarea-dezghețarea frecventă.
5) Produsul este potrivit pentru RT-qPCR într-o singură etapă, se recomandă adăugarea a 10-20 U transcriptază inversă pentru fiecare sistem de reacție de 25μL sau creșterea treptat a cantității de revers transcriptază în funcție de situația actuală.
Note
1.Vă rugăm să păstrați zona experimentală curată;În timpul funcționării, trebuie purtate mănuși și măști curate.Toate consumabilele utilizate în experiment ar trebui să fie fără RNază pentru a preveni contaminarea cu RNază.
2.Toate procedurile trebuie efectuate pe gheață pentru a preveni degradarea ARN.
3.Se recomandă probe de ARN de înaltă calitate pentru a asigura o eficiență ridicată a transcripției inverse.
4.Acest produs este destinat exclusiv cercetării.
5.Vă rugăm să operați cu halate de laborator și mănuși de unică folosință, pentru siguranța dumneavoastră.
