ARNm Cap2'-O-metiltransferaza

ARNm Cap 2'-O-metiltransferaza a fost derivată dintr-o tulpină recombinantă de E. coli care poartă gena pentru ARNm Cap 2'-O-metiltransferaza vaccinia.Această enzimă adaugă o grupare metil la poziția 2'-O a primei nucleotide adiacente structurii capacului de la capătul 5' al ARN-ului. -0) rezultând o structură cap- 1.

Structura Cap1 poate crește eficiența translației, îmbunătățind expresia ARNm în experimentele de transfecție și microinjecție. Această enzimă necesită în mod specific ARN cu un capac m7GpppN ca substrat.Nu poate utiliza ARN cu pN, ppN, pppN sau GpppN la capătul 5'.ARN-ul acoperit poate fi preparat prin transcripție in vitro utilizând analog-cap sau prin acoperire enzimatică folosind enzima de acoperire Vaccinia.

Componente

ARNm Cap 2'-O-metiltransferaza (50U/μL)

10×Tampon de reacție de acoperire

Depozitare

-25 ～- 15℃ pentru depozitare （ Evitați ciclurile repetate de îngheț-dezgheț）

Buffer de stocare

20 mM Tris-HCI (pH 8,0, 25℃), 100 mM NaCI, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glicerol.

Definiția unității

O unitate este definită ca cantitatea de enzimă necesară pentru a metila 10 pmol de transcript de ARN acoperit de 80 nt în 1 oră la 37°C.

Teste de control al calității

Exonucleaza: 50 U de ARNm Cap 2' -O-metiltransferaza cu 1 μg ADN digerat λ-Hind III la 37 ℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare după cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

Endonucleaza: 50 U de ARNm Cap 2'-O-metiltransferaza cu 1 μg λADN la 37℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare, după cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

Nickase: 50 U de ARNm Cap 2' -O-metiltransferaza cu 1 μg pBR322 la 37 ℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare, după cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

RNază: 50U de ARNm Cap 2' -O-metiltransferaza cu 1,6μg ARN MS2 timp de 4 ore la 37℃ nu produce nicio degradare, după cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

E. coli ADN: 50U de ARNm Cap 2 ´ -O-metiltransferaza sunt testate pentru prezențaE. coli ADN genomic folosind TaqMan qPCR cu primeri specifici pentruE. coli Locusul ARNr 16S.TheE. coli contaminarea ADN-ului genomic este =1E. coli genomului.

Bacterian Endotoxina: test LAL, conform Farmacopeei Chineze IV ediția 2020, metoda de testare a limitei gelului, regula generală (1143).Conținutul de endotoxină bacteriană ar trebui să fie = 10 EU/mg.

Sistem de reacție și condiții

1. Combinați o cantitate adecvată de ARN cu cap și H2O fără RNază într-un tub de microcentrifugă de 1,5 mL până la un volum final de 16,0 µL.

2. Se încălzește la 65℃ timp de 5 minute, urmată de o baie cu gheață timp de 5 minute.

3. Adăugați următoarele componente în ordinea specificată (pentru metilarea ARN-ului acoperit

Mai putin decât 10

*10× Tampon de reacție de acoperire: 500 mM Tris-HCI (pH 8,0, 25℃), 50 mM KCI, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Incubați la 37℃ timp de 1 oră (se recomandă 2 ore de incubare pentru fragmentul țintă mai mic de 200 nt).

Aplicații

Pentru a îmbunătăți expresia ARNm în timpul experimentelor de microinjecție și transfecție.

Note despre utilizare

1. Înainte de reacție, ARN-ul trebuie purificat și dizolvat în apă fără nucleaze, toate soluțiile nu trebuie să conțină EDTA și ioni.

2. Se recomandă încălzirea probei de ARN la 65℃ timp de 5 minute înainte de reacție pentru a îndepărta structura secundară de la capătul 5 al transcriptului.Ar putea fi extins la 10 minute pentru structura complexă de 5 ´-terminale.