PNGase F
Peptida-N-glicozidaza F (PNGaza F) este cea mai eficientă metodă enzimatică pentru îndepărtarea aproape tuturor oligozaharidelor N-legate din glicoproteine.PNGaza F este o amidază, care se scindează între resturile cele mai interne de GlcNAc și asparagină ale oligozaharidelor mari, hibride și complexe din glicoproteinele N-legate.
Aplicație
Această enzimă este utilă pentru îndepărtarea reziduurilor de carbohidrați din proteine.
Pregătirea și specificarea
| Aspect | Lichid incolor |
| Puritatea proteinelor | ≥95% (din SDS-PAGE) |
| Activitate | ≥500.000 U/ml |
| Exoglicozidaza | Nu a putut fi detectată nicio activitate (ND) |
| Endoglicozidaza F1 | ND |
| Endoglicozidaza F2 | ND |
| Endoglicozidaza F3 | ND |
| Endoglicozidaza H | ND |
| Proteaza | ND |
Proprietăți
| numărul CE | 3.5.1.52(Recombinant din microorganism) |
| Greutate moleculară | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Punct izoelectric | 8. 14 |
| pH optim | 7,0-8,0 |
| Temperatura optima | 65 °C |
| Specificitatea substratului | Scindarea legăturilor glicozidice dintre GlcNAc și resturile de asparagină Fig.1 |
| Site-uri de recunoaștere | Glicani N-legați, cu excepția cazului în care conțin α1-3 fucoză Fig. 2 |
| Activatori | TDT |
| Inhibitor | SDS |
| Temperatura de depozitare | -25 ~ -15 ℃ |
| Inactivarea căldurii | Un amestec de reacție de 20 uL care conține 1 uL de PNGază F este inactivat prin incubare la 75 °C timp de 10 minute. |
Fig. 1 Specificitatea substratului PNGazei F
Fig. 2 Locurile de recunoaștere ale PNGasei F.
Când reziduurile interne de GlcNAc sunt legate de α1-3 fucoză, PNGaza F nu poate scinda oligozaharidele N-legate din glicoproteine.Această modificare este comună la plante și la unele glicoproteine ale insectelor.
Coponenţi
|
| Componente | Concentraţie |
| 1 | PNGase F | 50 pl |
| 2 | 10 × tampon de denaturare glicoproteină | 1000 pl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 pl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 pl |
Definiția unității
O unitate (U) este definită ca cantitatea de enzimă necesară pentru a elimina >95% din carbohidratul din 10 pg de RNază B denaturată într-o oră la 37°C într-un volum total de reacție de 10 pL.
Condiții de reacție
1. Se dizolvă 1-20 µg de glicoproteină cu apă deionizată, se adaugă 1 µl tampon de denaturare cu glicoproteină 10× și H2O (dacă este necesar) pentru a obține un volum total de reacție de 10 µl.
2.Se incubează la 100°C timp de 10 minute, se răcește pe gheață.
3.Se adaugă 2 ui 10×GlycoBuffer 2, 2 ui 10% NP-40 și se amestecă.
4.Se adaugă 1-2 µl PNGază F și H2O (dacă este necesar) pentru a obține un volum total de reacție de 20 µl și amestecați.
5.Se incubează reacția la 37°C timp de 60 min.
6.Pentru analiza SDS-PAGE sau analiza HPLC.
