Enzima de acoperire a virusului Vaccinia

Enzima de acoperire a virusului Vaccinia este derivată dintr-o tulpină recombinată de E. coli care poartă genele pentru enzima de acoperire Vaccinia.Această enzimă unică este compusă din două subunități (D1 și D12) și are trei activități enzimatice (ARN trifosfatază și guanililtransferază de subunitatea D1 și guanin metiltransferaza de subunitatea D12).Enzima de acoperire a virusului Vaccinia este eficientă pentru a cataliza formarea structurii capacului, care poate atașa în mod specific structura capacului de 7-metilguanilat (m7Gppp, Cap 0) la capătul 5′ al ARN-ului.Structura capacului (Cap 0) joacă un rol important în stabilizarea, transportul și translația ARNm la eucariote.Limitarea ARN-ului prin reacție enzimatică este o metodă eficientă și simplă care poate îmbunătăți semnificativ stabilitatea și translația ARN-ului pentru transcripția, transfecția și microinjecția in vitro.

Componente

Enzima de acoperire a virusului Vaccinia (10 U/μL)

10×Tampon de acoperire

Conditii de depozitare

-25～- 15℃ pentru depozitare （ Evitați ciclurile repetate de îngheț-dezgheț）

Buffer de stocare

20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM NaCI,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glicerol.

Definiția unității

O unitate de enzimă de acoperire a virusului Vaccinia este definită ca cantitatea de enzimă necesară pentru a încorpora 10 pmol de GTP într-un transcript de 80nt în 1 oră la 37°C.

Control de calitate

Exonucleaza:10U de enzimă de acoperire a virusului Vaccinia cu 1 μg ADN digerat λ-Hind III la 37 ℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

Endonucleaza:10U de enzimă de acoperire a virusului Vaccinia cu 1μg λADN la 37℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

Nickase:10U de enzimă de acoperire a virusului Vaccinia cu 1 μg pBR322 la 37 ℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

RNază:10U de enzimă de acoperire a virusului Vaccinia cu 1,6 μg MS2 ARN timp de 4 ore la 37 ℃ nu produce nicio degradare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.

1.coli ADN:10U de enzimă de acoperire a virusului Vaccinia este analizată pentru prezența ADN-ului genomic de E. coli utilizând qPCR TaqMan cu primeri specifici pentru locusul ARNr 16S de E. coli.Contaminarea ADN-ului genomic cu E. coli este ≤1 genomul E. coli.

2.Bacterian Endotoxina: Testul LAL, conform Farmacopeei Chineze IV ediția 2020, metoda de testare a limitei gelului, regula generală (1143).Conținutul de endotoxine bacteriene trebuie să fie ≤10 EU/mg.

Sistem de reacție și condiții

1. Protocol de plafonare (volum de reacție: 20 μL)

Această procedură este aplicabilă reacției de acoperire a 10μg ARN (≥100 nt) și poate fi extinsă în funcție de cerințele experimentale.

I) Se combină 10 μg ARN și H2O fără nucleaze într-un tub de microcentrifugă de 1,5 ml până la un volum final de 15,0 μL.*10×Tampon de acoperire: 0,5M Tris-HCI, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) Se încălzește la 65℃ timp de 5 minute, urmată de o baie cu gheață timp de 5 minute.

3) Adăugați următoarele componente în ordinea specificată

*10×Tampon de acoperire: 0,5 M Tris-HCI, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

4) Se incubează la 37°C timp de 30 de minute, ARN-ul este acum acoperit și gata pentru aplicații în aval.

2. 5′ terminal reacție de etichetare (volum de reacție: 20 μL)

Acest protocol este conceput pentru a eticheta ARN-ul care conține un trifosfat de 5' și poate fi extins în funcție de cerințe.Eficiența încorporării etichetei va fi afectată de raportul molar ARN: GTP, precum și de conținutul de GTP din probele de ARN.

1) Combinați cantitatea adecvată de ARN și H2O fără nucleaze într-un tub de microcentrifugă de 1,5 ml până la un volum final de 14,0 µL.

2) Se încălzește la 65℃ timp de 5 minute, urmată de o baie cu gheață timp de 5 minute.

3) Adăugați următoarele componente în ordinea specificată.

** GTP MIX se referă la GTP și la un număr mic de markeri.Pentru concentrația de GTP, consultațila nota 3.

4) Incubați la 37°C timp de 30 de minute, capătul ARN 5′ este acum etichetat și gata pentru aval

Aplicații

1. Limitarea ARNm înainte de testele de translație/translatarea in vitro

2. Marcarea capătului 5' al ARNm

Note despre utilizare

1.Încălzirea soluției de ARN înainte de incubare cu Vaccinia Capping Enzyme îndepărtează structura secundară de la capătul 5 al transcriptului.Prelungiți timpul la 60 de minute pentru transcrierile cu capete 5 bine structurate cunoscute.

2. ARN-ul utilizat pentru reacțiile de acoperire trebuie purificat înainte de utilizare și suspendat în apă fără nucleaze.EDTA nu trebuie să fie prezent și soluția trebuie să fie lipsită de săruri.

3. Pentru marcarea capătului 5’, concentrația totală de GTP ar trebui să fie de aproximativ 1-3 ori concentrația molară de ARNm din reacție.

4. Volumul sistemului de reacție poate fi mărit sau mic în funcție de realitatea.