Kit EndoFree Plasmid Maxi
Acest kit este potrivit pentru extracția din 150 – 300 ml de soluție bacteriană cultivată peste noapte, folosind o metodă îmbunătățită de liză alcalină SDS pentru a liza bacteriile.Extractul brut este combinat selectiv cu un Captator de Endotoxină unic și separat prin centrifugare pentru a elimina endotoxinele.Apoi, membrana gelului de silice se leagă selectiv de ADN-ul plasmid din soluție în condiții de sare ridicată și pH scăzut.Aceasta este urmată de adăugarea de tampon de spălare pentru a îndepărta impuritățile și alte componente bacteriene.În cele din urmă, un tampon de eluție cu conținut scăzut de sare și pH ridicat este utilizat pentru a elua ADN-ul plasmid pur din membrana matricei de siliciu.Membrana de silicagel folosește o membrană specială de adsorbție, iar diferența de cantitate de adsorbție dintre coloană și coloană este foarte mică, iar repetabilitatea este bună.Fenolul, cloroformul și alți reactivi toxici nu sunt necesari și nici etapele de precipitare a etanolului.Acest kit poate fi folosit pentru a extrage rapid 0,2 -1,5 mg de ADN plasmid pur cu copii mari, cu o rată de extracție de 80% -90%.Kitul folosește o formulă unică de proces care elimină endotoxina, conținutul de endotoxină este extrem de scăzut și efectul de transfecție celulară este excelent.Plasmida extrasă ar putea fi utilizată direct în digestia enzimatică, PCR, transcripție in vitro, transformare, secvențiere și alte experimente de biologie moleculară.
Conditii de depozitare
RNaseA trebuie depozitat la -30 ~ -15℃ și transportat la ≤0℃.
Endotoxin Scavenger poate fi depozitat la 2 ~ 8℃ timp de o lună, depozitat la -30 ~ -15℃ pentru depozitare pe termen lungși transportat la ≤0℃.
Alte componente trebuie păstrate la temperatura camerei (15 ~ 25℃) și transportate la temperatura camerei.
Componente
| Componente | 10RXNS |
| RNaza A | 750 μL |
| tampon P1 | 75 ml |
| tampon P2 | 75 ml |
| tampon P4 | 75 ml |
| Captator de endotoxine | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Tampon TB | 20 ml |
| Coloane FastPure DNA Maxi (fiecare într-un tub de colectare de 50 ml) | 10 |
| Tub de colectare fără endotoxine | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, utilizat pentru îndepărtarea ARN-ului.
Buffer P1:tampon de suspensie bacteriană, adăugați RNaseA la tamponul P1 înainte de prima utilizare.
Buffer P2:tampon de liză bacteriană (conținând SDS/NaOH).
Buffer P4:tampon de neutralizare.
Captator de endotoxine:elimina eficient endotoxina din extractul de plasmid brut.
PW tampon:tampon de spălare, adăugați volumul de etanol prevăzut înainte de prima utilizare.
TB tampon:tampon de eluție.
Coloane FastPure DNA Maxi:coloane de adsorbție ADN plasmidic.
Tuburi de colectare 50 ml:tuburi de colectare a filtratului.
Tub de colectare fără endotoxine:tuburi de colectare a ADN plasmidic.
Materiale pregătite
Etanol absolut, izopropanol, tuburi de centrifugă cu fund rotund de 50 ml și 50 ml fără endotoxinetuburi de centrifuga.
Aplicații
Acest produs este potrivit pentru extracția pe scară largă a plasmidelor de la 150 - 300 ml de soluție bacterianăcultivat peste noapte.
Procesul de experiment
1. Luați 150 – 200 ml (nu mai mult de 300 ml) de soluție bacteriană cultivată peste noapte și centrifugați laaproximativ 11.000 rpm (12.000 × g) timp de 1 – 2 min.Aruncați supernatantul și colectați bacteriile.
Δ Când se colectează mai mult de 50 ml de soluție bacteriană, bacteriile pot fi colectate prin adăugarea de soluție bacteriană, centrifugare, aruncarea supernatantului și alte etape în același tub de 50 ml pentru
de mai multe ori.
2. Adăugați 7,5 ml de tampon P1 (vă rugăm să verificați dacă RNaseA a fost adăugată la tamponul P1) în centrifugătub care conține bacterii și amestecați bine prin vortex sau pipetare.
Δ Resuspendarea completă a bacteriilor în această etapă este esențială pentru randament și nu ar trebui să existe aglomerări bacteriene după resuspendare.Dacă există aglomerări bacteriene care nu sunt bine amestecate, aceasta va afecta liza, rezultând un randament și puritate scăzute.Dacă OD600 a soluției bacteriene este de 0,65, se recomandă utilizarea a 7,5 ml de tampon P1 la extragerea din 150 ml de soluție bacteriană;când OD600 este de 0,75, trebuie utilizați 8 ml de tampon P1 și volumele de tampon P2 și P4 trebuie modificate în consecință.Dacă volumul soluției bacteriene crește la 200 ml, se recomandă cavolumul tamponurilor P1, P2 și P4 să fie crescut proporțional.
3. Adăugați 7,5 ml de tampon P2 la suspensia bacteriană de la pasul 2 și amestecați ușor în sus și în jos timp de 6 – 8de ori și se incubează la temperatura camerei timp de 4-5 min.
Δ Răsturnați ușor pentru a amesteca bine.Vortexarea va cauza fragmentarea ADN-ului genomic, rezultând fragmente de ADN genomic în plasmida extrasă.În acest moment, soluția devine vâscoasă și translucidă, arătând că bacteriile au fost complet lizate.Durata nu trebuie să depășească 5 minute pentru a evita distrugerea plasmidelor.Dacă soluția nu este limpede, pot apărea prea multe bacteriiliză incompletă, astfel încât cantitatea de bacterii ar trebui redusă în mod corespunzător.
4. Adăugați 7,5 ml de tampon P4 la suspensia bacteriană de la pasul 3 și inversați imediat ușor de 6 – 8 ori pentru a permite soluției să neutralizeze complet tamponul P2.În acest moment, ar trebui să apară un precipitat alb floculant.Se centrifugă la mai mult de aproximativ 11.000 rpm (12.000 × g) timp de 10 – 15 minute, se pipetă cu atenție supernatantul într-un tub nou de centrifugă cu fund rotund de 50 ml (pregătit singur) și se evităaspiră precipitatul alb plutitor.
Δ Adăugați tampon P4 și inversați imediat pentru a amesteca bine.Lăsați tubul să stea până când precipitatul alb este distribuit uniform în soluție pentru a preveni producerea de precipitații locale care ar putea afecta neutralizarea.Dacă nu există un precipitat uniform alb floculant înainte de centrifugare și supernatantul nu este limpede după centrifugare, tubul poate ficentrifugată încă 5 min.
5. Adăugați de 0,1 ori volumul (10% din volumul supernatantului, aproximativ 2,2 ml) de Endotoxin Scavenger la supernatantul de la etapa 4 și inversați pentru a amesteca.Puneți soluția într-o baie de gheață sau introduceți-l în gheață pisată (sau congelator frigider) timp de 5 minute până când soluția se schimbă de la tulbure la limpede și transparentă (sau încăușor tulbure) și ocazional amestecați de mai multe ori.
Δ După ce absorbantul de endotoxină este adăugat la supernatant, supernatantul va deveni tulbure, darsupernatantul trebuie să devină limpede (sau ușor tulbure) după răcire în baia de gheață.
6. După ce supernatantul este plasat la temperatura camerei (>25℃) timp de 10 – 15 min, acesta va deveni tulbure pe măsură cetemperatura acestuia crește până la temperatura camerei.Apoi supernatantul trebuie inversat pentru a se amesteca.
Δ Dacă temperatura camerei este mai scăzută sau doriți să reduceți timpul de extracție, supernatantul poate fi incubat într-o baie de apă la 37 ~ 42 ℃ timp de 5 – 10 minute și următorul pas poate fi efectuat după supernatantdevine tulbure.
7. Centrifugă supernatantul la aproximativ 11.000 rpm (12.000 × g) timp de 10 minute la temperatura camerei (temperatura trebuie să fie >25℃) pentru a separa faza.Faza apoasă superioară conține ADN-ul, în timp ce stratul inferior de fază uleioasă albastră conține endotoxină și alte impurități.Transferațifază apoasă care conține ADN într-un tub nou șiaruncați stratul uleios.
Δ Temperatura în timpul centrifugării trebuie să fie peste 25℃, deoarece separarea efectivă a fazelor nuapar dacă temperatura este prea scăzută.
Δ Dacă separarea fazelor nu este eficientă, temperatura de centrifugare poate fi ajustată la 30℃ șitimpul de centrifugare poate fi mărit la 15 min.
Δ Nu aspirați stratul uleios albastru deoarece conține endotoxină și alte impurități.
Mecanism
Neutralizarea lizei prin resuspensie
◇ Adăugați 7,5 ml tampon P1
◇ Adăugați 7,5 ml tampon P2
◇ Adăugați 7,5 ml tampon P4
Îndepărtarea endotoxinelor
◇Adăugați de 0,1 ori volumul supernatantului de Endotoxin Scavenger
Legare și spălare
◇ Adăugați de 0,5 ori volumul de izopropanol
◇ Adăugați 10 ml de tampon PW
◇ Adăugați 10 ml de tampon PW
Eluare
◇ Adăugați 1 – 2 ml tampon TB sau ddH2O fără endotoxină
