5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Cat No: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) este un amestec extrem de stabil pe bază de sondă într-un singur tub, potrivit pentru transcripție inversă într-un singur pas și PCR cantitativă (qRT-PCR).Susține pre-amestecarea primerilor și a sondelor și rămâne stabil după depozitare îndelungată la temperatură scăzută.Proba de testat poate fi adăugată direct în timpul utilizării, fără operație suplimentară de deschidere/pipettare a tubului.Acest produs oferă componente, de exemplu ADN polimerază cu pornire la cald, M-MLV, ADN glicozilază uracil labilă la căldură (TS-UNG), inhibitor de RNază, MgCl2, dNTP-uri (cu dUTP în loc de dTTP) și stabilizatori.Cu transcriptaza inversă de amplificare rapidă modificată genetic și polimeraza ADN, este posibil să se finalizeze amplificarea PCR în 20-40 de minute.Acest reactiv folosește tampon special pentru qPCR cu enzime mixte de enzimă de amplificare anti-inhibitoare și enzimă UNG.Prin urmare, poate obține o bună amplificare a genelor țintă și poate preveni amplificarea falsă cauzată de poluarea reziduală PCR și de aerosoli.Acest reactiv este compatibil cu majoritatea instrumentelor PCR cantitative cu fluorescență de la producători precum Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad și Roche.
Componentă
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Conditii de depozitare
Toate componentele trebuie păstrate la -20℃ pentru depozitare pe termen lung și 4℃ timp de până la 3 luni.Vă rugăm să amestecați bine după decongelare și să centrifugeți înainte de utilizare.Evitați înghețarea-dezghețarea frecventă.
Pregătirea sistemului de reacție qRT-PCR
| Componente | 25μLSistem | 50μLSistem | Concentrarea finală |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Amestec amorsare-sondăa | 1μL | 2μL | 1× |
| ARN șablonb | – | – | – |
| ddH2O | Până la 25μL | Până la 50μL | – |
1) a.Concentrația finală de grund este de obicei 0,2μM.Pentru rezultate mai bune, concentrația primerului poate fi optimizată în intervalul 0,2-1μM.În general, concentrația sondei poate fi optimizată în intervalul 0,1-0,3μM.
2) b. Când se utilizează o procedură de PCR rapidă, creșterea concentrației de primeri și sonde poate duce la rezultate de amplificare mai bune, iar raportul acestora trebuie optimizat în consecință.
3) Diferite tipuri de probe conțin diferite tipuri și conținut de inhibitor și numărul de copii ale genei țintă.Volumul probei trebuie luat în considerare în funcție de starea reală.Se face o diluție a probei cu apă fără nuclează sau cu tampon TE, dacă este necesar.
Reacția Cconditii
| Procedura PCR obișnuită | Procedură PCR rapidă | ||||||
| Procedură | Temp. | Timp | Ciclu | Procedură | Temp. | Timp | Ciclu |
| Transcriere inversă | 50℃ | 10-20 minute | 1 | Transcriere inversă | 50℃ | 5 minute | 1 |
| Polimeraza Activare | 95℃ | 1-5 minute | 1 | Polimeraza Activare | 95℃ | 30 de ani | 1 |
| Denaturarea | 95℃ | 10-20 de ani | 40-50 | Denaturarea | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Recoacerea și Extensie | 56-64℃ | 20-60 ani | Recoacerea și Extensie | 56-64℃ | 3-20 de ani | ||
Control de calitate
1.Detectarea funcției: sensibilitatea, specificitatea și repetabilitatea qPCR.
2.Fără activitate de nuclează exogenă: fără endonuclează exogenă și poluare cu exonuclează.
Note
1.Rata de amplificare a ADN polimerazei rapide nu este mai mică de 1 kb/10s.Diferitele instrumente PCR au viteze diferite de încălzire și răcire, moduri de control al temperaturii și conductivitate termică și, prin urmare, optimizarea concentrației amorsului/sondei și a metodei de rulare în combinație cu instrumentul PCR rapid specific este esențială.
2.Acest produs are aplicabilitate largă și este potrivit pentru diagnosticarea moleculară de înaltă sensibilitate.Metoda PCR în trei etape este recomandată pentru primeri cu temperatură scăzută de recoacere sau pentru amplificarea fragmentelor lungi de peste 200 bp.
3.Deoarece diferiți ampliconi au o eficiență diferită de utilizare a dUTP și o sensibilitate diferită la UNG, reactivii ar trebui optimizați dacă sensibilitatea de detecție scade atunci când se utilizează sistemul UNG.Vă rugăm să ne contactați pentru asistență tehnică dacă este necesar.
4.Pentru a evita amplificarea produselor PCR transferate, pentru amplificare sunt necesare o zonă experimentală dedicată și o pipetă.Operați cu mănuși și schimbați frecvent și nu deschideți tubul PCR după amplificare.
