RTL Reverse Transcriptaza
RTL revers transcriptaza este o ADN polimerază dependentă de șablon de ARN care nu are activitatea exonucleazei 3'→5' și are activitate RNază H.Această enzimă poate folosi ARN-ul ca matriță pentru a sintetiza o catenă complementară de ADN, care poate fi aplicată la sinteza ADNc-ului primei catene, în special pentru RT-LAMP (amplificare izotermă mediată de buclă).În comparație cu transcriptaza inversă RTL 1.0, sensibilitatea este îmbunătățită semnificativ, stabilitatea termică este mai puternică și reacția la 65°C este mai stabilă.Transcriptaza inversă RTL (fără glicerol) poate fi utilizată pentru a prepara preparate liofilizate, reactivi RT-LAMP liofilizați etc.
Definiția unității
O unitate încorporează 1 nmol de dTTP într-un material precipitabil cu acid în 20 de minute la 50°C utilizând poli(A)•oligo(dT)25 ca amorsare șablon.
Componente
| Componentă | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Transcriptază inversă RTL (fără glicerol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL tampon | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3×10 ml |
Starea de depozitare
Transport sub 0°C și păstrat la -25°C~-15°C.
Control de calitate
- Activitate reziduala aEndonucleaza:O reacție de 50 μL care conține 1 μg de λADN și 15 unități de RTL2.0 incubate timp de 16 ore la 37 ℃ prezintă același model ca și controlul negativ prin electroforeză pe gel.
- Activitate reziduala aExonucleaza:O reacție de 50 μL care conține 1 μg de λDNA digerat Hind Ⅲ și 15 unități de RTL2.0 incubate timp de 16 ore la 37 ℃ prezintă același model ca și controlul negativ prin electroforeză pe gel.
- Activitate reziduala aNickase:O reacție de 50 μL care conține 1 μg de pBR322 supercoilat și 15 unități de RTL2.0 incubate timp de 4 ore la 37°C prezintă același model ca și controlul negativ prin electroforeză pe gel.
- Activitate reziduala aRNază:O reacție de 10 μL care conține 0,48 μg de ARN MS2 și 15 unități de RTL2.0 incubate timp de 4 ore la 37°C prezintă același model ca și controlul negativ prin electroforeză pe gel.
- E coli gADN:Măsurat cuE colikituri specifice de detectare a HCD, 15 unități de RTL2.0 conțin mai puțin de 1E coligenomului.
Configurarea reacției
Protocolul de sinteză a ADNc
| Componente | Volum |
| ARN șablon a | opțional |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) sau amestec aleatoriu de primer (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10 mM fiecare) | 1 μL |
| Inhibitor de RNază (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptaza 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL tampon | 2 μL |
| Apă fără nucleaze | Până la 20 μL |
Note:
1) Doza recomandată de ARN total este de 1ng~1μg
2) Doza recomandată de ARNm a fost de 50ng~100ng
Termo-ciclism Condiţii pentru o rutină reacţie:
| Temperatura (°C) | Timp |
| 25 °Ca | 5 minute |
| 55 °C | 10 minuteb |
| 80 °C | 10 minute |
Note:
1) Dacă se folosește Random Primer Mix, o etapă de incubare la 25°C.
2) Dacă se utilizează amestecul de primer țintă, o etapă de incubare la 55°C timp de 10~30 minute.
Protocolul RT-LAMP
| Componente | Volum | Concentrarea finală |
| ARN șablon | opțional | ≥10 copii |
| Mix dNTP (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Grunduri FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Grunduri F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Primeri LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibitor de RNază (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reacție |
| RTL Reverse Transcriptaza 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/reacție |
| ADN polimerază Bst V2 (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reacție |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (sau 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Apă fără nucleaze | Până la 25 μL | - |
Note:
1) Amestecați prin vortexare și centrifugați scurt pentru a colecta.Incubare la temperatură constantă la 65°C timp de 1 oră.
2) Cele două tampoane sunt interoperabile și au aceeași compoziție.
Note
1. Acest produs va forma un solid alb atunci când este depozitat la -20 °C.Scoate-l de la -20°C și pune-l pe gheață aproximativ 10 minute.După topire, poate fi folosit prin agitare și amestecare.
2. Produsul ADNc poate fi păstrat la -20°C sau -80°C sau utilizat imediat pentru reacția PCR.
3. Pentru a preveni contaminarea cu RNază, vă rugăm să păstrați zona experimentală curată și să purtați mănuși și măști curate în timpul funcționării.
