Mini kit de extracție ADN
Acest kit adoptă un sistem tampon optimizat și tehnologia de purificare a coloanei cu silicagel, care poate recupera fragmente de ADN de 70 bp – 20 kb din diferite concentrații de gel de agaroză TAE sau TBE.Coloana de adsorbție a ADN-ului poate adsorba ADN-ul în mod special în condiții de sare bogată.În plus, trusa poate purifica direct fragmente de ADN din produse PCR, sisteme de reacție enzimatică sau produse ADN brute obținute prin alte metode și poate îndepărta impuritățile precum proteinele, alți compuși organici, ionii de sare anorganică și primerii oligonucleotidici.Se poate asigura că purificarea poate fi finalizată în 10-15 minute.ADN-ul purificat poate fi utilizat direct pentru ligatură, transformare, digestie enzimatică, transcripție in vitro, PCR, secvențiere, microinjecție etc.
Conditii de depozitare
Depozitați la -15 ~ -25℃ și transportați la temperatura camerei.
Componente
| Componente | (100 rxns) |
| PIB tampon | 80 ml |
| Tampon GW | 2 × 20 ml |
| Tampon de eluție | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Coloane-G | 100 |
PIB tampon:tampon de legare ADN.
Buffer GW:Tampon de spălare;adăugați etanol absolut cu volumul indicat pe flacon înainte de utilizare.
Tampon de eluție:Eluare.
Mini coloane FastPure DNA-G:Coloane de adsorbție ADN.
Tuburi de colectare 2 ml:Tuburi de colectare pentru filtrat.
Materiale pregătite
Tuburi sterilizate de 1,5 ml, etanol absolut și izopropanol (când fragmentul de ADN ≤100 bp, adăugați 1 volum
izopropanol la 1 volum de gel), baie de apă.
Procesul de experiment
Adăugați 80 ml de etanol pentru a dilua Buffer GW așa cum este indicat pe etichetă înainte de utilizare, păstrați la temperatura camerei.
Mecanism
1. Soluție de reacție PCR
Schema de extracție a gelului: Adăugați volum egal tampon GDP Schema de recuperare a soluției de reacție PCR:Adăugați de 5 ori volumul tampon
2. PIB Calculați volumul de gel (100 μl este egal cu 100 mg)
Se dizolvă gelul
3. Preîncălziți la 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Adăugați 300 μL de tampon GDP*
Adăugați 700 μL de tampon GW
Adăugați 700 μL de tampon GW
5. Eluează
Adăugați 20 – 30μL de tampon de eluție sau apă deionizată
Note* Recuperarea fluidului de reacție PCR fără acest pas
Program de extracție cu gel
1. După electroforeza ADN pentru fracţionarea fragmentelor de ADN, excizaţi singura dungă de fragment de ADN din gelul de agaroză sub lumină UV.Se recomandă utilizarea hârtiei absorbante pentru a absorbi umezeala aparentă a gelului și pentru a minimiza dimensiunea feliei de gel prin îndepărtarea agarozei suplimentare pe cât posibil.Se cântărește felia de gel (fără tub de microcentrifugă) pentru a-și calcula volumul: Volumul feliei de gel de 100 mg este de aproximativ 100 μL, presupunând că densitatea este de 1 g/ml.
2. Adăugați volum egal Buffer GDP, incubați la 50~55℃ timp de 7-10 minute (în funcție de dimensiunea gelului, ajustați timpul de incubare până când gelul se dizolvă complet).Întoarceți tubul de 2 ori în timpul incubației.
Δ Adăugarea a 1-3 volume de GDP tampon nu va influența eficiența recuperării ADN-ului.Dacă fragmentul de ADN care urmează să fie recuperat <100 bp, trebuie adăugate 3 volume de tampon GDP;când felia de gel s-a dizolvat complet, adăugați 1 volum de izopropanol și amestecați bine, apoi continuați cu pasul următor.
3. Centrifugați scurt pentru a aduce proba la fundul tubului, introduceți FastPure DNA Mini Columns-G în tuburile de colectare 2 ml, transferați cu atenție soluția de maximum 700 μL o dată pe
timp până la coloanele de filtrare, se centrifugă la 12.000 rpm (13.800 X g) timp de 30-60 sec.
4. Aruncați filtratul și adăugați 300 μL de Buffer GDP în coloană, incubați la temperatura camerei timp de 1 minut, centrifugați la 12.000 rpm (13.800 X g) timp de 30-60 sec.
5. Aruncați filtratul și adăugați 700 μL de Buffer GW (verificați în prealabil dacă a fost adăugat etanol absolut!) în coloană, centrifugați la 12.000 rpm (13.800 X g) timp de 30-60 sec.
Δ Vă rugăm să adăugați Buffer GW în jurul peretelui coloanei de adsorbție sau adăugați capacul din spate Buffer GW și amestecați-l cu capul în jos de 2 – 3 ori pentru a ajuta la spălarea completă a sării care aderă de peretele tubului.
6. Repetați pasul 5.
Δ Spălarea cu tampon GW de două ori poate asigura că sarea este complet îndepărtată și poate elimina impactul asupra experimentelor ulterioare.
7. Se aruncă filtratul și se centrifughează coloana goală la 12.000 rpm (13.800 X g) timp de 2 min.
8. Introduceți coloana într-un tub de microcentrifugă curat de 1,5 ml, adăugați 20 - 30 μL de tampon de eluție în centrul membranei coloanei, incubați timp de 2 minute și apoi centrifugeți la 12.000 rpm (13.800 X g) timp de 1 min.Aruncați coloana, depozitați ADN-ul obținut la -20°C.
Δ Transferarea supernatantului din etapa 8 în coloană pentru a elua din nou și preîncălzirea tamponului de eluție la 55 (când fragmentul de ADN > 3 kb) poate fi utilă pentru a crește eficiența recuperării.
Program de recuperare a produselor PCR
Acest protocol este aplicabil pentru purificarea fragmentelor de ADN din produsele PCR, sistemul de reacție enzimatică și alte produse brute ADN (inclusiv ADN genetic).Această soluție poate îndepărta eficient diferite nucleotide, primeri, dimeri de primer, molecule de sare, enzime și alte impurități.
1. Centrifugați pe scurt produsele PCR, soluția de reacție enzimatică și alte produse brute ADN.Estimați-le volumul cu pipeta și transferați într-un tub sterilizat de 1,5 ml sau 2 ml.Adăugați ddH2O până la volumul de până la 100 μL;în timp ce pentru ADN-ul genomic cu concentrație mare, diluarea la 300 μL cu ddH2O va ajuta la îmbunătățirea eficienței recuperării.
2. Adăugați 5 volume de Buffer GDP, amestecați bine prin răsturnarea sau agitarea în vortex.Dacă fragmentul de ADN de interes > 100 bp, trebuie adăugate 1,5 volume suplimentare (probe + GDP tampon) de etanol.
3. Introduceți coloana înapoi în tubul de colectare, transferați amestecul pe coloană, centrifugeți la 12.000 rpm (13.800 ×g) timp de 30 – 60 sec.Dacă volumul soluției amestecate este > 700 µL, puneți coloana de adsorbție înapoi în tubul de colectare, transferați soluția rămasă în coloana de adsorbție și centrifugeți la 12.000 rpm (13.800 × g) timp de 30 – 60 sec.
4. Următoarea performanță se referă la pasul 5 – 8 din programul de extracție 08- 1/Gel.
Aplicații
Diverse concentrații de gel de agaroză TAE sau TBE;Produse PCR, sisteme de reacție enzimatică sau alte produse ADN brute obținute prin diferite metode.Fragmentele recuperate au variat de la70 bp -20 kb.
Note
Numai pentru uz de cercetare.A nu se utiliza în proceduri de diagnosticare.
1. Adăugați 80 ml de etanol pentru a dilua Buffer GW așa cum este indicat pe etichetă înainte de utilizare, păstrați la temperatura camerei.
2. Dacă Buffer GDP este ușor de precipitat în timpul depozitării la temperaturi scăzute, acesta poate fi plasat la temperatura camerei pentru o perioadă de timp înainte de utilizare.Dacă este necesar, poate fi preîncălzit într-o baie de apă la 37℃ până când precipitatul este complet dizolvat, apoi poate fi folosit după amestecare.
3. Setați în avans temperatura băii de apă la 50 ~ 55℃.
4. În pasul 1 al programului de extracție 08-1/Gel, reducerea la minimum a dimensiunii feliei de gel va reduce semnificativ timpul de dizolvare și va crește eficiența recuperării (ADN-ul liniarizat este ușor de hidrolizat când este expus continuu la temperatură ridicată).Nu expuneți gelul ADN la UV pentru o perioadă lungă de timp, deoarece lumina ultravioletă poate provoca deteriorarea ADN-ului.
5. Dizolvați complet gelul în pasul 2 al programului de extracție 08- 1/Gel, altfel eficiența recuperării ADN-ului va fi grav afectată.
6. Preîncălziți tamponul de eluție sau ddH2O la 55℃, ceea ce este util pentru a îmbunătăți eficiența eluției ADN.Se recomandă păstrarea ADN-ului în eluent de 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
