Inhibitor de Rnaza
Inhibitorul de RNază murină este un inhibitor de RNază murină recombinant exprimat și purificat din E.coli.Se leagă de RNaza A, B sau C într-un raport de 1:1 prin legături necovalente, inhibând astfel activitatea celor trei enzime și protejând ARN-ul de degradare.Cu toate acestea, nu este eficient împotriva RNază 1, RNază T1, nuclează S1, RNază H sau RNază de la Aspergillus.Inhibitorul de RNază murină a fost testat prin RT-PCR, RT-qPCR și ARNm IVT și a fost compatibil cu diferite transcriptaze inverse, ADN polimeraze și ARN polimeraze comerciale.
În comparație cu inhibitorii de RNază umani, inhibitorul de RNază murin nu conține două cisteine care sunt foarte sensibile la oxidare care determină inactivarea inhibitorului.Acest lucru îl face stabil la concentrații scăzute de DTT (mai puțin de 1 mM).Această caracteristică îl face potrivit pentru utilizarea în reacții în care concentrațiile mari de DTT sunt negative pentru reacție (de exemplu, RT-PCR în timp real).
Aaplicație
Acest produs poate fi utilizat pe scară largă în orice experiment în care interferența RNază este posibilă pentru a evita degradarea ARN, cum ar fi:
1.Sinteza primei catene de ADNc, RT-PCR, RT-qPCR etc.
2.Protejează ARN-ul de degradare în timpul transcripției/translației in vitro (de exemplu, sistemul de replicare virală in vitro).
3.Inhibarea activității RNazei în timpul separării și purificării ARN.
Conditii de depozitare
Produsul poate fi depozitat la -25～- 15 ℃, valabil 2 ani.
Buffer de stocare
50 mM KCI, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25°C), 8 mM DTT și 50% glicerol.
Definiția unității
Cantitatea de inhibitor de RNază murină necesară pentru a inhiba activitatea a 5 ng de ribonuclează A cu 50% a fost definită ca o unitate (U).
Greutatea moleculară a proteinei
Greutatea moleculară a inhibitorului de RNază murină este de 50 kDa.
Control de calitate
Exonucleaza Activitate:
40 U de inhibitor de RNază murină cu 1 μg λ-Hind III digeră ADN la 37℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.
Activitatea endonucleazei:
40 U de inhibitor de RNază murină cu 1 μ g λ ADN la 37 ℃ timp de 16 ore nu produc nicio degradare așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.
Nicking Activitate:
40 U de inhibitor de RNază murină cu 1 μ g pBR322 la 37 ℃ timp de 16 ore nu produce nicio degradare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.
RNază Activitate:
40 U de inhibitor de RNază murină cu 1,6 μ g MS2 ARN timp de 4 ore la 37 ℃ nu produc nicio degradare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză.
E.coli ADN:
40 U de inhibitor de RNază murină sunt testate pentru prezența ADN-ului genomic de E. coli utilizând qPCR TaqMan cu primeri specifici pentru locusul ARNr 16S de E. coli.Contaminarea ADN-ului genomic cu E. coli este ≤ 0,1 pg/40 U.
Notes
1. Oscilația sau agitarea violentă va duce la inactivarea enzimei.
2. Intervalul optim de temperatură al acestui inhibitor a fost de 25-55 ℃ și a fost inactivat la 65 ℃ și peste.
3. Activitățile RNazei H, RNazei 1 și RNazei T1 nu au fost inhibate de inhibitorul de RNază murin.
4. Inhibarea activității RNazei a fost găsită într-o gamă largă de pH (pH 5-9 au fost toate active), iar cea mai mare activitate a fost observată la pH 7-8.
5. Deoarece ribonucleazele păstrează în mod obișnuit activitatea în condiții de denaturare, trebuie avută grijă pentru a evita denaturarea moleculelor de inhibitor de RNază care s-au complexat cu o ribonuclează.Pentru a preveni eliberarea ribonucleazei active, temperaturile mai mari de 50 °C și concentrațiile mari de uree sau alți agenți de denaturare trebuie evitate.
