Proteinaza K NGS (pulbere)
Cat No: HC4507A
NGS Proteaza K este o serin protează stabilă cu activitate enzimatică mare și specificitate mare pentru substrat.Deci, este adesea folosit pentru a degrada proteinele în peptide scurte.NGS Proteaza K este o serin protează tipică cu Asp39-A lui69-Ser224triada catalitică, care este unică pentru serin proteaze, iar centrul catalitic este înconjurat de câlți de Ca2+situsuri de legare pentru stabilizare, menținând o activitate enzimatică ridicată într-o gamă mai largă de condiții.
Specificație
| Aspect | Pulbere amorfă albă până la aproape albă, liofilizată |
| Activitate specifică | ≥40U/mg solid |
| ADNază | Nu a fost detectat niciunul |
| RNază | Nu a fost detectat niciunul |
| Povara biologică | ≤50 CFU/g solid |
| Reziduu de acid nucleic | <5pg/mg solid |
Proprietăți
| Sursă | album Tritirachium |
| numărul CE | 3.4.21.64(Recombinant din albumul Tritirachium) |
| Greutate moleculară | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Punct izoelectric | 7.81 Fig.1 |
| pH optim | 7,0-12,0 (Toți efectuează activitate ridicată) Fig.2 |
| Temperatura optima | 65℃ Fig.3 |
| Stabilitate pH | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Stabilitate termică | Sub 50℃ (pH 8,0, 30min) Fig.5 |
| Stabilitate la depozitare | Stocat la 25℃ timp de 12 luni Fig.6 |
| Activatori | SDS, uree |
| Inhibitori | Fluorofosfat de diizopropil;fluorură de benzilsulfonil |
Conditii de depozitare
Păstrați pulberea liofilizată la -25 ~ -15 ℃ pentru o perioadă lungă de timp ferit de lumină;După dizolvare, alicotă în volum adecvat pentru depozitare pe termen scurt la 2-8℃ departe de lumină sau depozitare pe termen lung la -25~-15 ℃ ferit de lumină.
Precauții
Purtați mănuși de protecție și ochelari de protecție atunci când utilizați sau cântăriți și păstrați-l bine ventilat după utilizare.Acest produs poate provoca reacții alergice ale pielii și iritații grave ale ochilor.Dacă este inhalat, poate provoca simptome de alergie sau astm sau dispnee.Poate provoca iritarea căilor respiratorii.
Definiția unității
O unitate de NGS Protează K este definită ca cantitatea de enzimă necesară pentru a hidroliza cazeina în 1 μmol L-tirozină în condiții standard de determinare.
Prepararea reactivilor
| Reactiv | Producător | Catalog |
| Cazeina tehnicădin lapte de bovine | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Acid tricloracetic | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetat de sodiu | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Acid acetic | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| acid clorhidric | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Bicarbonat de sodiu | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folină-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co, Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirozină | Sigma | 93829 |
Reactiv I:
Substrat: 1% cazeină din soluție de lapte de bovine: se dizolvă 1 g cazeină din lapte de bovină în 50 ml de soluție de fosfat de sodiu 0,1 M, pH 8,0, se încălzește în baie de apă la 65-70 °C timp de 15 minute, se amestecă și se dizolvă, se răcește cu apă, ajustată prin hidroxid de sodiu la pH 8,0 și se diluează la 100 ml.
Reactiv II:
Soluție TCA: acid tricloracetic 0,1 M, acetat de sodiu 0,2 M și acid acetic 0,3 M (se cântăresc 1,64 g acid tricloracetic + 1,64 g acetat de sodiu + 1,724 ml acid acetic succesiv, se adaugă 50 ml apă deionizată, se ajustează pH-ul în diHC03). 100 ml).
Reactiv III:
0,4 m soluție de carbonat de sodiu (se cântăresc 4,24 g de carbonat de sodiu anhidru și se dizolvă în 100 mL apă)
Reactiv IV:
Reactiv Folin fenol: se diluează de 5 ori cu apă deionizată.
Reactiv V:
Diluant enzimatic: soluție de fosfat de sodiu 0,1 M, pH 8,0.
Reactiv VI:
Soluție standard de L-tirozină: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozină dizolvată cu HCI 0,2M.
Procedură
1. Porniți spectrofotometrul UV-Vis și selectați măsurarea fotometrică.
2. Setați lungimea de undă la 660 nm.
3. Porniți baia de apă, setați temperatura la 37℃, asigurați-vă că temperatura este neschimbată timp de 3-5 minute.
4. Preîncălziți 0,5 ml substrat într-un tub de centrifugă de 2 ml la o baie de apă de 37℃ timp de 10 minute.
5. Extrageți 0,5 ml soluție de enzimă diluată în tubul de centrifugă preîncălzit timp de 10 minute.Setați diluantul enzimatic ca grup martor.
6. Adăugați 1,0 ml de reactiv TCA imediat după reacție.Se amestecă bine și se incubează în baie de apă timp de 30 de minute.
7. Se centrifugă soluția de reacție.
8. Adăugați următoarele componente în ordinea specificată.
| Reactiv | Volum |
| Supernatant | 0,5 ml |
| Carbonat de sodiu 0,4M | 2,5 ml |
| Folin fenol reactiv | 0,5 ml |
9. Amestecați bine înainte de incubare în baie de apă la 37℃ timp de 30 de minute.
10. OD660a fost determinată ca OD1;Grup martor martor: Diluantul enzimatic este utilizat pentru a înlocui soluția de enzimă pentru a determina DO660ca OD2, AOD=OD1-OD2.
11. Curba standard L-tirozină: 0,5 ml soluție de L-tirozină cu concentrație diferită, 2,5 ml 0,4 M carbonat de sodiu, 0,5 ml reactiv Folin fenol în tub de centrifugă de 5 ml, se incubează la 37 ℃ timp de 30 de minute, se detectează OD660pentru diferite concentrații de L-tirozină, apoi s-a obținut curba standard Y=kX+b, unde Y este concentrația de L-tirozină, X este OD600.
Calcul
2: Volumul total al soluției de reacție (mL)
0,5: Volumul soluției de enzimă (mL)
0,5: Volumul lichidului de reacție utilizat în determinarea cromogenă (mL)
10: Timp de reacție (min)
Df: Multiplu de diluare
C: Concentrația enzimei (mg/mL)
Cifre
Fig.1 Reziduu de ADN
| Probă | Ave C4 | Acid nucleic Recuperare (pg/mg) | Recuperare(%) | Nucleic total Acid ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O fără ARN | Nedeterminat | — | — | — |
Fig.2 pH-ul optim
Fig.3 Temperatura optimă
Fig.4 Stabilitatea pH-ului
Fig.5 Stabilitate termică
Fig.6 Stabilitate la depozitare la 25℃
