2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Cat No: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) este proiectat pentru a efectua PCR direct din probe fără extracția ADN sau pregătirea probei.Acest reactiv constă din ADN polimerază cu pornire la cald, uracil ADN glicozilază (UNG), inhibitor de RNază, MgCl2, dNTP-uri (cu dUTP în loc de dTTP) și stabilizatori, pentru PCR cantitativă (qPCR).Acest reactiv are o toleranță ridicată la inhibitor și, prin urmare, poate fi aplicat direct la detectarea probelor cum ar fi tamponul gâtului, saliva, sângele integral anticoagulant, plasmă și ser fără extracție de ADN.Reactivul folosește tampon propriu pentru qPCR cu enzime mixte de ADN polimerază anti-inhibitoare și enzimă UNG.Prin urmare, poate obține o bună amplificare a genelor țintă în probele care conțin inhibitori și poate inhiba amplificarea fals pozitivă cauzată de poluarea reziduală și de aerosoli PCR.Acest reactiv este compatibil cu majoritatea instrumentelor PCR cantitative fluorescente, cum ar fi Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche și așa mai departe.
Componente
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Conditii de depozitare
Toate componentele trebuie păstrate la -20℃ pentru depozitare pe termen lung și 4℃ timp de până la 3 luni.Vă rugăm să amestecați bine după decongelare și să centrifugeți înainte de utilizare.Evitați înghețarea-dezghețarea frecventă.
Protocol de ciclism
| Etapa | Temperatura | Timp | Ciclu |
| Digestie | 50℃ | 2 min | 1 |
| Activarea polimerazei | 95℃ | 1-5 min | 1 |
| Denatura | 95℃ | 10-20 de ani | 40-50 |
| Recoacere/Extindere | 56-64℃ | 20-60 ani |
Instrucțiuni de pipetare
| Reactiv | Volumul per reacţie | Volumul pe reacție | Concentrarea finală |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µL | 1 µL | 1× |
| 25×Amestec amorsare-sondă1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Probă3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volum total | 25 μL | 50 μL | - |
1. Concentrația finală de primer este de obicei 0,2μM.Pentru rezultate mai bune, concentrația primerului poate fi optimizată în intervalul 0,2-1μM.
2. În general, concentrația sondei poate fi optimizată în intervalul 0,1-0,3μM.Concentrația optimă a sondei este legată de instrumentul de amplificare PCR în timp real, tipul de sondă și tipul de substanță de marcare fluorescentă.Vă rugăm să consultați manualul instrumentului sau cerințele specifice fiecărei sonde fluorescente.
3. Diferite tipuri de probe conțin diferite tipuri și conținut de inhibitor și numărul de copii ale genei țintă.Volumul probei trebuie luat în considerare în funcție de starea reală.Se face o diluție a probei adăugând apă fără nuclează sau tampon TE, dacă este necesar.
4. Volumul recomandat de diferite probe:
| Probă | Volum pentru un 50 μL reacţie | Maxim raport |
| Sânge integral anticoagulant | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30% |
| Ser | 10 μL | 20% |
| Tampon pentru gât | 10 μL | 20% |
| Salivă | 10 μL | 20% |
Control de calitate
1. Detectarea funcției: sensibilitatea, specificitatea și repetabilitatea qPCR.
2. Fără activitate de nuclează exogenă: fără endonuclează exogenă și poluare cu exonuclează.
Note de produs
1. Acest produs folosește un nou tip de ADN polimerază cu pornire la cald, care poate fi activată în 1-5 minute. Deoarece tamponul său de reacție a fost optimizat, este mai potrivit pentru PCR cantitativă cu fluorescență dublă sau multiplă folosind metoda sondei.
2. Dacă valoarea Rn a amplificării PCR este prea mică sau amplificarea este în mod evident inhibată, scăderea cantității de probă, creșterea volumului de reacție sau diluarea anterioară a probei poate îmbunătăți rezultatele.
3. Colectarea de sânge, salivă, urină, tampon de gât etc. trebuie să respecte cerințele criteriilor clinice, iar probă proaspătă poate fi utilizată pentru a preveni degradarea acidului nucleic.
4. Deoarece diferiți ampliconi au eficiență de utilizare diferită față de dUTP și sensibilitate la UNG, reactivii ar trebui optimizați dacă sensibilitatea de detecție scade atunci când se utilizează sistemul UNG.Vă rugăm să ne contactați pentru asistență tehnică dacă este necesar.
5. Pentru a evita amplificarea produselor PCR transferate între reacțiile într-o singură etapă, pentru amplificare sunt necesare o zonă experimentală dedicată și o pipetă.Operați cu mănuși și schimbați frecvent și nu deschideți tubul de reacție după amplificarea PCR.
