Proteinaza K mNGS (lichid)
Proteinaza K este o serin protează stabilă cu specificitate largă de substrat.Degradează multe proteine în stare nativă chiar și în prezența detergenților.Dovezile din studiile asupra structurii cristaline și moleculare indică faptul că enzima aparține familiei subtilizinelor cu o triadă catalitică cu situs activ (Asp39-A lui69-Ser224).Locul predominant de clivaj este legătura peptidică adiacentă grupării carboxil a aminoacizilor alifatici și aromatici cu grupări alfa amino blocate.Este folosit în mod obișnuit pentru specificitatea sa largă.Această proteinază K este special concepută pentru mNGS.În comparație cu cealaltă proteinază K, conține și mai puțină contaminare cu acid nucleic cu aceeași performanță enzimatică, ceea ce ar putea asigura mai bine aplicarea mNGS în aval.
Conditii de depozitare
2-8℃ timp de 2 ani
Specificație
| Aspect | Lichid incolor până la maro deschis |
| Activitate | ≥800 U/ml |
| Concentrația de proteine | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Nu a fost detectat niciunul |
| ADNază | Nu a fost detectat niciunul |
| RNază | Nu a fost detectat niciunul |
Proprietăți
| numărul CE | 3.4.21.64(Recombinant din albumul Tritirachium) |
| Punct izoelectric | 7,81 |
| pH optim | 7,0- 12,0 Fig. 1 |
| Temperatura optima | 65 ℃ Fig. 2 |
| stabilitatea pH-ului | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Stabilitate termică | Sub 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Stabilitate la depozitare | Peste 90% activitate timp de 12 luni la 25 ℃ |
| Activatori | SDS, uree |
| Inhibitori | Fluorofosfat de diizopropil;fluorură de fenilmetilsulfonil |
Aplicații
1. Trusa de diagnostic genetic
2. Truse de extracție ARN și ADN
3. Extracția componentelor non-proteice din țesuturi, degradarea impurităților proteice, cum ar fi ADN-ulvaccinuri si prepararea heparinei
4. Prepararea ADN-ului cromozomial prin electroforeză pulsată
5. Western blot
6. Reactivi albumină glicozilată enzimatică diagnostic in vitro
Precauții
Purtați mănuși de protecție și ochelari de protecție atunci când utilizați sau cântăriți și păstrați-l bine ventilat după utilizare.Acest produs poate provoca reacții alergice ale pielii și iritații grave ale ochilor.Dacă este inhalat, poate provoca simptome de alergie sau astm sau dispnee.Poate provoca iritarea căilor respiratorii.
Definiția unității
O unitate (U) este definită ca cantitatea de enzimă necesară pentru a hidroliza cazeina pentru a produce 1 μmoltirozină pe minut în următoarele condiții.
Prepararea reactivilor
Reactiv I: 1 g cazeină din lapte a fost dizolvată în 50 ml de soluție de fosfat de sodiu 0,1 M (pH 8,0), incubată în apă la 65-70 ℃ timp de 15 minute, agitată și dizolvată, răcită cu apă, ajustată cu hidroxid de sodiu la pH 8,0 și volum fix 100 ml.
Reactiv II: acid tricloracetic 0,1 M, acetat de sodiu 0,2 M, acid acetic 0,3 M.
Reactiv III: 0,4 M Na2CO3soluţie.
Reactiv IV: reactiv Forint diluat cu apă pură de 5 ori.
Reactiv V: Diluant enzimatic: soluție de fosfat de sodiu 0,1 M (pH 8,0).
Reactiv VI: soluție de tirozină: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozină dizolvată cu 0,2M HCI.
Procedură
1. 0,5 ml de reactiv I este preîncălzit la 37℃, se adaugă 0,5 ml de soluție de enzimă, se amestecă bine și se incubează la37℃ timp de 10 minute.
2. Adăugați 1 ml de reactiv II pentru a opri reacția, amestecați bine și continuați incubarea timp de 30 de minute.
3. Se centrifugă soluția de reacție.
4. Luați 0,5 ml supernatant, adăugați 2,5 ml reactiv III, 0,5 ml reactiv IV, amestecați bine și incubați la 37 ℃timp de 30 de minute.
5. OD660a fost determinată ca OD1;Grup martor martor: 0,5 ml de reactiv V este utilizat pentru a înlocui enzimasoluție pentru determinarea OD660ca OD2, AOD=OD1-OD2.
6. Curba standard L-tirozină: 0,5 ml soluție de L-tirozină cu concentrație diferită, 2,5 ml reactiv III, 0,5 ml reactiv IV în tub de centrifugă de 5 ml, incubați la 37 ℃ timp de 30 de minute, detectați OD660pentru diferite concentrații de L-tirozină, apoi s-a obținut curba standard Y=kX+b, unde Y este concentrația de L-tirozină, X este OD600.
Calcul
2: Volumul total al soluției de reacție (mL)
0,5: Volumul soluției de enzimă (mL)
0,5: Volumul lichidului de reacție utilizat în determinarea cromogenă (mL)
10: Timp de reacție (min)
Df: Multiplu de diluare
C: Concentrația enzimei (mg/mL)
Referințe
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.comun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EURO.J. Biochim.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Clonarea moleculară: un manual de laborator, ediția a 2-a, Cold Spring HarborPresa de laborator, Cold Spring Harbor (1989).
Cifre
Smochin.1 Optim pH
Soluție tampon 100 mM: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCI;pH 9,0-12,5, glicină-NaOH. Concentrația enzimei: 1 mg/mL
Fig.2 Temperatura optimă
Reacția în tampon K-fosfat 20 mM pH 8,0.Concentrația enzimei: 1 mg/mL
Fig.3 pH Stabilitate
25 ℃, 16 h-tratament cu soluție tampon 50 mM: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-Acid clorhidric.pH 9,0-12,5, Glicină-NaOH.Concentrația enzimei: 1 mg/mL
Fig.4 Termice stabilitate
Tratament de 30 min cu tampon Tris-HCI 50 mM, pH 8,0.Concentrația enzimei: 1 mg/mL
Fig.5 Depozitare stabilty at 25℃
