Kit PCR direct pentru plante

Cat Nr: HCR2020A

Kitul Plant Direct PCR este potrivit pentru amplificarea directă a frunzelor plantelor, semințelor etc. și poate fi utilizat pentru screening-ul de mare capacitate a probelor de plante care nu conțin polizaharide și polifenoli.ADN polimeraza cu amplificare directă bazată pe evoluția direcționată are toleranță superioară la inhibitorii PCR din plante.Între timp, menține performanța ridicată de amplificare, care este potrivită pentru amplificarea fragmentelor de ADN în 5 kb.Tamponul unic de liză A din kit poate fi utilizat pentru a liza țesuturile vegetale proaspete sau congelate.Este ușor de operat, iar lizatul poate fi folosit ca șablon pentru amplificare fără purificare.Sistemul conține agenți de protecție care permit amplificarea eficientă a probelor brute după înghețare și decongelare repetă.2 × Plant Direct Master Mix trebuie doar să adauge primeri și șabloane pentru a efectua reacția de amplificare, reducând astfel operațiunile de pipetare și îmbunătățind randamentul de detecție și reproductibilitatea rezultatelor.

Componente

*Plant Direct Lysis Buffer B este un reactiv opțional, care este utilizat pentru a neutraliza Plant Direct Lysis Buffer A pentru prelungirea timpului de depozitare a probelor.Poate fi folosit în funcție de situația actuală.

Conditii de depozitare

2 × Plant Direct Master Mix, depozitați la -30 ~ -15℃ și evitați înghețarea și dezghețarea repetate;Tampon de liză directă a plantelor, depozitați la -30 ~ -15℃ sau 2 ~ 8℃.

Procesul de experiment

Prelucrarea probelor–Frunza de plante

Metoda directa:Se recomandă utilizarea frunzelor tinere.Utilizați un perforator cu un diametru fix de 0,5 – 3 mm pentru a obține o probă mică și uniformă, apoi adăugați direct proba în sistemul PCR (se recomandă sistemul de 50 μl).Rețineți, asigurați-vă că proba se află în soluția PCR și nu pe peretele tubului.Dacă PCR directă este utilizată pentru a amplifica fragmente lungi și probe complexe, utilizarea unei probe cu un diametru mai mic (0,5 – 1 mm) ca șablon poate ajuta la obținerea unor rezultate mai bune.

Metoda de liză de măcinare:Se recomandă utilizarea frunzelor tinere.Luați o bucată mică de frunză (aproximativ 1 – 3 mm în diametru), puneți-o în 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab și măcinați-o cât mai mult posibil (acest pas se poate face prin strângerea frunzei cu un vârf de pipetă de 100 μl a zdrobi proba) .Dacă sunt utilizate volume mai mari de țesut de frunze (nu depășesc 7 mm), creșteți volumul tamponului de diluție la 50 μl.După ce frunzele sunt măcinate, soluția ar trebui să apară verde.După o scurtă centrifugare, adăugați 1 μl de supernatant în sistemul PCR ca șablon de reacție.

Metoda de liză termică:Se recomandă utilizarea frunzelor tinere.Luați o bucată mică de frunză (aproximativ 1 – 3 mm în diametru), puneți-o în 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A și încălziți-o la 95°C timp de 5 – 10 min.Timpul de liză poate fi prelungit în mod corespunzător pentru frunzele greu de lizat (nu mai mult de 20 de minute).Dacă sunt utilizate volume mai mari de țesut de frunze (nu depășesc 7 mm), creșteți volumul tamponului de diluție la 50 μl.După încălzire, se centrifugează scurt și se adaugă 1 μl de supernatant în sistemul PCR ca șablon de reacțieb.

Prelucrarea probelor– Sămânță de plante

Metoda de liză de măcinare:Folosiți un bisturiu pentru a tăia semințele cu un diametru de 5 mm, adăugați-le la 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A și măcinați proba cu un vârf de pipetă sau alte instrumente.Vortexați scurt și lăsați să stea la temperatura camerei timp de 3 – 5 minute.Asigurați-vă că proba de semințe este scufundată în tamponul de diluție.După o scurtă centrifugare, adăugați 1 μl de supernatant în sistemul PCR ca șablon de reacție.

Metoda de liză termică:Folosiți un bisturiu pentru a tăia semințele cu diametrul de 5 mm, adăugați-le la 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A și încălziți la 95°C timp de 5 – 10 min.Timpul de liză poate fi prelungit în mod corespunzător pentru frunzele care sunt greu de lizat (nu mai mult de 30 de minute).După încălzire, se centrifugează scurt și se adaugă 1 μl de supernatant în sistemul PCR ca șablon de reacțieb.

A.Foarfecele sau alte unelte pot fi, de asemenea, folosite pentru a tăia mostre de dimensiuni adecvate;dacă pumnul sau foarfecele sunt refolosite, acestea trebuie curățate cu soluție de hipoclorit de sodiu 2% înainte de fiecare utilizare pentru a preveni contaminarea încrucișată între probe.

b.Asigurați-vă că tamponul de liză directă a plantelor este complet topit înainte de utilizare.Dacă tamponul este vâscos sau are precipitate, acesta poate fi încălzit la 37℃ pentru a se topi complet înainte de utilizare.

c.Volumul șablonului din sistemul de reacție poate fi ajustat corespunzător în funcție de diferența de volum de material vegetal și de diluant adăugat.

Tampon de liză directă a plantelor

Tamponul A de liză directă a plantelor conținut în acest produs a fost strict optimizat pentru a elibera genomul majorității țesuturilor plantelor și este potrivit pentru depozitarea pe termen scurt a plantelor brute la 4℃.Dacă proba trebuie păstrată pentru o perioadă mai lungă de timp (de exemplu, 1 – 2 luni), se recomandă transferul supernatantului într-un tub EP nou și depozitarea acestuia la -20℃.Pentru a stoca probele mai stabil, adăugați un volum egal de Plant Direct Lysis Buffer B la supernatantul transferat, amestecați bine și păstrați la -20℃.Timpul de depozitare stabil variază în funcție de probele și stările plantelor.

Sistem de reacție

A.Contine Mg²⁺la o concentrație finală de 2 mM.

b.Se recomandă utilizarea unei concentrații finale de 0,4μM pentru fiecare grund.Utilizarea excesivă a primerilor va duce la o amplificare nespecifică crescută.

c.Cantitatea de probă utilizată poate fi ajustată în funcție de situația reală.Cantitatea utilizată într-o singură reacție de probă brută lizată poate fi ajustată între 2% – 20% din volumul total al reacției.Folosirea prea multor mostre poate cauza eșec de amplificare.

Program de reacție

A.Denaturarea inițială (98℃, 5 min) promovează liza țesutului vegetal, eliberând ADN genomic care poate fi utilizat pentru amplificarea PCR.Nu scurtați timpul și nu reduceți temperatura.

b.Se recomandă să-l setați egal cu valoarea Tm primerului sau cu 2 ~ 4℃ mai mare decât valoarea Tm.ADN-polimeraza cu amplificare directă utilizată în acest produs este diferită de ADN polimeraza Taq convențională și are cerințe speciale pentru temperatura de recoacere a reacției; utilizarea unei temperaturi ridicate de recoacere poate reduce eficient amplificarea nespecifică și poate îmbunătăți eficiența amplificării.Pentru șabloane complexe, amplificarea eficientă poate fi realizată prin ajustarea temperaturii de recoacere și prelungirea timpului de extensie.

c.Dacă lungimea produsului de amplificare este ≤1 kb, timpul de extensie este setat la 30 sec/kb;dacă lungimea produsului de amplificare este >1 kb, timpul de extensie este setat la 60 sec/kb.

d.Pentru probe complexe sau probe cu randament scăzut de amplificare, numărul de cicluri poate fi crescut în mod corespunzător la 40 -50 de cicluri.

Aplicații

Este aplicabil pentru amplificarea directă a țesuturilor plantelor și screening-ul cu randament ridicat a probelor de plante care nu conțin polizaharide și polifenoli.

Note

Numai pentru uz de cercetare.A nu se utiliza în proceduri de diagnosticare.

1. Pentru amplificarea brută a plantelor sau amplificarea directă, se recomandă utilizarea ADN-ului genomic purificat ca martor pozitiv înainte de a începe experimentul pentru a se asigura că sistemul, primerii și operațiile sunt corecte.

2. ADN polimeraza cu amplificare directă utilizată în acest kit are o activitate puternică de corectare.Dacă trebuie efectuată clonarea TA, se recomandă purificarea ADN-ului înainte de adăugarea adeninei.

3. Ghid pentru proiectarea primerului:

A.Se recomandă ca ultima bază de la capătul 3′ al grundului să fie G sau C.

b.Nepotrivirile consecutive trebuie evitate în ultimele 8 baze de la capătul 3′ al primerului.c.Evitați structurile în ac de păr la capătul 3′ al grundului.

d.Diferențele dintre valoarea Tm a primerului direct și a primerului invers nu trebuie să fie mai mare de 1℃, iar valoarea Tm trebuie ajustată la 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5 este recomandat pentru a calcula valoarea Tm).

e.Secvențele de primer suplimentare care nu sunt potrivite cu șablonul nu ar trebui incluse la calcularea valorii Tm a primerului.

f.Se recomandă ca conținutul de GC al grundului să fie de 40% -60%.

g.Distribuția generală a lui A, G, C și T în primer ar trebui să fie cât mai uniformă posibil.Evitați utilizarea regiunilor cu conținut ridicat de GC sau AT.

h.Evitați prezența secvențelor complementare a 5 sau mai multe baze fie în interiorul primerului, fie între doi primeri și evitați prezența secvențelor complementare a 3 sau mai multe baze la capătul 3′ al doi primeri.

i.Utilizați funcția NCBI BLAST pentru a verifica specificitatea primerului pentru a preveni amplificarea nespecifică.