ADN polimeraza Wild Taq
Taq DNA Polymerase este o ADN polimerază termostabilă de la Thermus aquaticus YT-1, care posedă o activitate de polimerază 5′→3′ și o activitate de endonuclează lambou 5′.
Componente
| Componentă | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Taq Buffer | 2×1 ml | 2×10 ml | 2×50 ml | 5×200 ml |
| Taq ADN polimerază (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5×10 ml |
Starea de depozitare
Transport sub 0°C și păstrat la -25°C~-15°C.
Definiția unității
O unitate este definită ca cantitatea de enzimă care încorporează 15 nmol de dNTP în material insolubil în acid în 30 de minute la 75°C.
Control de calitate
1.Testul de puritate a proteinei (SDS-PAGE):Puritatea ADN polimerazei Taq a fost ≥95% determinată prin analiza SDS-PAGE.
2.EndActivitatea onucleazei:Un minim de 5 U de ADN polimerază Taq cu 1 μg λADN timp de 16 ore la 37 ℃ nu duce la nicio degradare detectabilă, după cum s-a determinat.
3.Activitatea exonucleazei:Un minim de 5 U de ADN polimerază Taq cu 1 μg λ -Hind Ⅲ digeră ADN timp de 16 ore la 37 ℃ nu duce la nicio degradare detectabilă, după cum s-a determinat.
4.Activitate Nickase:Un minim de 5 U de ADN polimerază Taq cu 1 μg ADN pBR322 timp de 16 ore la 37°C nu are ca rezultat o degradare detectabilă, după cum s-a determinat.
5.Activitatea RNazelor:Un minim de 5 U de ADN polimerază Taq cu 1,6 μg ARN MS2 timp de 16 ore la 37°C nu are ca rezultat o degradare detectabilă, după cum s-a determinat.
6.E coliADN:5 U de ADN polimerază Taq sunt testate pentru prezența ADN-ului genomic de E. coli utilizând qPCR TaqMan cu primeri specifici pentru locusul ARNr 16S de E. coli.Contaminarea ADN-ului genomic cu E. coli este ≤1 copie.
7.Amplificare PCR (5,0 kb Lambda ADN)- O reacție de 50 µL care conține 5 ng ADN Lambda cu 5 unități de ADN polimerază Taq pentru 25 de cicluri de amplificare PCR are ca rezultat produsul așteptat de 5,0 kb.
Configurarea reacției
| Componente | Volum |
| ADN șablona | opțional |
| Primer Forward 10 μM | 1 μL |
| Grund invers 10 μM | 1 μL |
| dNTP Mix (10 mM fiecare) | 1 μL |
| 10×Taq Buffer | 5 μL |
| Taq ADN polimerazab | 0,25 μL |
| Apă fără nucleaze | Până la 50 μL |
Note:
1) Concentrația optimă de reacție a diferitelor șabloane este diferită.Următorul tabel arată utilizarea șablonului recomandat pentru sistemul de reacție de 50 µL.
| ADN | Cantitate |
| genomic | 1 ng-1 μg |
| Plasmid sau Viral | 1 pg-1 ng |
2) Concentrația optimă de ADN polimerază Taq poate varia de la 0,25 µL~1 µL în aplicații specializate.
ReacţieProgram
| Etapa | Temperatura(°C) | Timp | Cicluri |
| Denaturarea inițialăa | 95 ℃ | 5 minute | - |
| Denaturarea | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Cicluri |
| Recoacereab | 60 ℃ | 15 s | |
| Extensie | 72 ℃ | 1 kb/min | |
| Prelungire finală | 72 ℃ | 5 minute | - |
Note:
1) Condiția inițială de denaturare este potrivită pentru majoritatea reacțiilor de amplificare și poate fi modificată în funcție de complexitatea structurii șablonului.Dacă structura șablonului este complexă, timpul de pre-denaturare poate fi extins la 5 – 10 minute pentru a îmbunătăți efectul inițial de denaturare.
2) Temperatura de recoacere trebuie ajustată în funcție de valoarea Tm a grundului, care este în general setată la 3~5 ℃ mai mică decât valoarea Tm a grundului;Pentru șabloane complexe, este necesară ajustarea temperaturii de recoacere și extinderea timpului de extindere pentru a obține o amplificare eficientă.
