Premix universal SYBR GREEN qPCR (albastru)
Cat Nr: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (pe bază de colorant) este o pre-soluție pentru amplificarea PCR cantitativă de 2x în timp real, caracterizată prin sensibilitate și specificitate ridicate, este de culoare albastră și are efectul de urmărire a adăugării probei.Componenta de bază Taq ADN polimeraza folosește pornirea la cald a anticorpilor pentru a inhiba eficient amplificarea nespecifică datorită recoacirii primerului în timpul preparării probei.În același timp, formula adaugă factori de promovare pentru a îmbunătăți eficiența de amplificare a reacției PCR și pentru a egaliza amplificarea genelor cu conținuturi diferite de GC (30 ~ 70%), astfel încât PCR cantitativ să poată obține o relație liniară bună într-un larg cantitativ. regiune.Acest produs conține colorant special de referință pasiv ROX, care este aplicabil la majoritatea instrumentelor qPCR.Nu este necesar să ajustați concentrația ROX pe diferite instrumente.Este necesar doar să adăugați primeri și șabloane pentru a pregăti sistemul de reacție pentru amplificare.
Componente
Universal Blue qPCR Master Mix
Conditii de depozitare
Produsul este livrat cu pachete de gheață și poate fi păstrat la -25℃~-15℃ timp de 18 luni.Este necesar să se evite iradierea puternică a luminii la depozitarea sau pregătirea sistemului de reacție.
Specificație
| Concentraţie | 2× |
| Metoda de detectare | SYBR |
| Metoda PCR | qPCR |
| Polimeraza | Taq ADN polimeraza |
| Tipul eșantionului | ADN |
| Echipamente de aplicare | Majoritatea instrumentelor qPCR |
| Tip produs | Premix SYBR pentru PCR cantitativ cu fluorescență în timp real |
| Aplicați la (aplicare) | Expresia genelor |
Instrucțiuni
1.Sistemul de reacție
| Componente | Volum (μL) | Volum (μL) | Concentrarea finală |
| Premix universal SYBR GREEN qPCR | 25 | 10 | 1× |
| Primer (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/L |
| Grund invers (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/L |
| ADN | X | X | |
| ddH2O | pana la 50 | până la 20 | - |
[Notă]: Amestecați bine înainte de utilizare pentru a evita bulele excesive de la agitarea puternică.
a) Concentrația primerului: Concentrația finală a primerului este de 0,2 μmol/L și poate fi, de asemenea, ajustată între 0,1 și 1,0 μmol/L, după caz.
b) Concentrația șablonului: Dacă șablonul este soluție stoc de ADNc nediluată, volumul utilizat nu trebuie să depășească 1/10 din volumul total al reacției qPCR.
c) Diluarea șablonului: Se recomandă diluarea soluției stoc de ADNc de 5-10 ori.Cantitatea optimă de șablon adăugată este mai bună atunci când valoarea Ct obținută prin amplificare este de 20-30 de cicluri.
d) Sistem de reacție: Se recomandă utilizarea a 20μL sau 50μL pentru a asigura eficacitatea și repetabilitatea amplificării genei țintă.
e) Pregătirea sistemului: Vă rugăm să pregătiți în bancul super curat și să utilizați vârfurile și tuburile de reacție fără reziduuri de nuclează;se recomanda folosirea varfurilor cu cartuse filtrante.Evitați contaminarea încrucișată și contaminarea cu aerosoli.
2.Program de reacție
Program standard
| Pasul de ciclu | Temp. | Timp | Cicluri |
| Denaturarea inițială | 95℃ | 2 min | 1 |
| Denaturarea | 95℃ | 10 sec | 40 |
| Recoacere/Extindere | 60℃ | 30 sec★ | |
| Etapa curbei de topire | Valori implicite ale instrumentului | 1 | |
Program rapid
| Pasul de ciclu | Temp. | Timp | Cicluri |
| Denaturarea inițială | 95℃ | 30 sec | 1 |
| Denaturarea | 95℃ | 3 sec | 40 |
| Recoacere/Extindere | 60℃ | 20 sec★ | |
| Etapa curbei de topire | Valori implicite ale instrumentului | 1 | |
[Notă]: Programul rapid este potrivit pentru marea majoritate a genelor, iar programele standard pot fi încercate pentru gene cu structură secundară complexă individuală.
a) Temperatura și timpul de recoacere: Vă rugăm să ajustați în funcție de lungimea primerului și a genei țintă.
b) Achiziția semnalului de fluorescență (★): Vă rugăm să setați procedura experimentală în conformitate cu cerințele din instrucțiunile de utilizare a instrumentului.
c) Curba de topire: Programul implicit al instrumentului poate fi utilizat în mod normal.
3. Analiza Rezultatelor
Au fost necesare minimum trei replici biologice pentru experimentele cantitative.După reacție, curba de amplificare și curba de topire trebuie să fie confirmate.
3.1 Curba de amplificare:
Curba standard de amplificare este în formă de S.Analiza cantitativă este cea mai precisă atunci când valoarea Ct se încadrează între 20 și 30. Dacă valoarea Ct este mai mică de 10, este necesar să se dilueze șablonul și să se efectueze din nou testul.Când valoarea Ct este între 30-35, este necesară creșterea concentrației șablonului sau a volumului sistemului de reacție, astfel încât să se îmbunătățească eficiența amplificării și să se asigure acuratețea analizei rezultatelor.Când valoarea Ct este mai mare de 35, rezultatele testului nu pot analiza cantitativ expresia genei, dar pot fi utilizate pentru analiză calitativă.
3.2 Curba de topire:
Singurul vârf al curbei de topire indică faptul că specificitatea reacției este bună și poate fi efectuată o analiză cantitativă;dacă curba de topire prezintă vârfuri duble sau multiple, analiza cantitativă nu poate fi efectuată.Curba de topire prezintă vârfuri duble și este necesar să se judece dacă vârful non-țintă este dimer de primer sau amplificare nespecifică prin electroforeză pe gel de agaroză ADN.Dacă este un dimer de primer, se recomandă reducerea concentrației de primer sau reproiectarea primerilor cu eficiență ridicată de amplificare.Dacă este o amplificare nespecifică, vă rugăm să creșteți temperatura de recoacere sau să reproiectați primerii cu specificitate.
Note
Vă rugăm să purtați EIP-ul necesar, cum ar fi halat de laborator și mănuși, pentru a vă asigura sănătatea și siguranța!
Acest produs este NUMAI pentru cercetare!
